Fundamentele moleculare ale editării sensibile la metilare prin Cas9

Conform nature.com, nucleasele CRISPR–Cas9 a devenit un instrument puternic pentru manipularea genomului într-o gamă largă de organisme. Totuși, nu a reușit să valorifice pe deplin prezența răspândită a metilării ADN-ului în genomuri. În acest context, raportăm caracterizări biochimice, structurale și de editare a genomului uman pentru un Cas9 sensibil la metilare (ThermoCas9).

👉 Caracteristicile și condițiile de legare ale ThermoCas9

ThermoCas9 se leagă eficient și taie ADN-ul în amonte de motivul asociat protospacer (PAM) 5′-NNNNCGA-3′ sau 5′-NNNNCCA-3′ în condiții in vitro. Totuși, metilarea celei de-a cincea citozină din orice secvență PAM (5mCpG sau 5mCpC) inhibă semnificativ activitatea ThermoCas9. Structurile obținute prin criomicroscopie electronică ale ThermoCas9 în stările pre- și post-tăiere la o rezoluție de 2.8 Å, respectiv 2.2 Å, relevă baza moleculară pentru cerința stringentă a citozinei nemetilate în legarea PAM și oferă ghidaj pentru ingineria ulterioară a enzimelor.

Am demonstrat editarea sensibilă la metilare prin ThermoCas9 în linii celulare umane cu peisaje distincte ale metilării ADN-ului. Mai mult, am arătat că un ThermoCas9 îmbunătățit catalitic vizează eficient genele cu semnătură de expresie luminală, care sunt constant hipometilate la pacienții cu cancer mamar.

👉 Impactul editării sensibile la metilare asupra tratamentului cancerului mamar

Datorită sensibilității sale la metilarea ADN-ului, ThermoCas9 poate viza specific celulele cu hipometilare asociată bolii, adăugând un alt nivel de precizie tehnologiilor de editare a genomului.